Plant Cell Technology
PLANT PRESERVATIVE MIXTURE


PREVENZIONE DALLE CONTAMINAZIONI NELLE COLTURE VEGETALI IN VITRO

Le contaminazioni microbiche costituiscono uno dei problemi principali nella gestione dei laboratori di micropropagazione e di biotecnologie vegetali. Le fonti di contaminazione sono diverse e complesse. Le soluzioni al problema possono essere diverse, di natura chimica, tecnologica, fisica e saranno oggetto di questa ed altre note che seguiranno. Con questa nota prendiamo conoscenza di una miscela biocida, inventata e brevettata dal dr. Assaf Guri , dottore in genetica, genetica applicata, specializzato in breeding di vegetali e ricercatore all’Università di Hebron (Israele) e poi alla Michigan State University (USA)ed ora responsabile scientifico alla Plant Cell Technology Inc. USA.. La miscela chiamata Plant Preservative Mixture ® è specificatamente dedicata per un impiego in vitro nella coltura di tessuti vegetali.


PERCHE’ USARE LA MISCELA PLANT PRESERVATIVE MIXTURE ® NEI TERRENI COLTURALI

La miscela Plant Preservative Mixture ® o PPM ® è un biocida-preservante ad ampio spettro che uccide batteri e cellule fungine, previene la germinazione delle spore e a dosi elevate può eliminare la contaminazione endogena degli espianti. Il PPM ® colpisce enzimi fondamentali della catena del ciclo dell’acido citrico e nella catena di trasporto degli elettroni.
La miscela PPM ® viene prodotta dalla casa americana Plant Cell Technology Inc. . la miscela non inficia la capacità di germinazione dei semi, la proliferazione dei calli, la rigenerazione dei calli.
La miscela è termostabile, può essere aggiunta come normale componente ai terreni colturali ed è di regola meno dispendiosa degli antibiotici.

Che vantaggi offre l’impiego del Plant Preservative Mixture:

diversamente dagli antibiotici il PPM ® è ad ampio spettro ed efficace contro i funghi

il PPM ® è meno dispendioso degli antibiotici e quindi si può utilizzare per impieghi di routine



PROCEDURE D’IMPIEGO DELLA MISCELA
PLANT PRESERVATIVE MIXTURE ®

La dose di 0,05 - 0,2 % v/v di PPM ® aggiunto al terreno colturale prima o dopo la sterilizzazione in autoclave è sufficiente per prevenire la contaminazione ambientale (aria, acqua , mani) e per eliminare contaminazioni endogene di scarsa entità. Per eliminare contaminazioni endogene più alte le procedure di lavoro prevedono dosi di PPM ® più elevate.

fig. semi di Aster posti su terreno di germinazione
In basso, senza PPM® nel terreno, i semi sono sopraffatti dalle muffe;
in alto la germinazione in presenza di PPM®: non ci sono muffe.


L’eliminazione delle contaminazioni dei semi.
Porre i semi in agitazione per 8 - 12 ore in una soluzione di PPM ® dell’1-2 % v/v, addizionata di 50 mg/l di sali di magnesio (cloruro di magnesio, solfato di magnesio, nitrato di magnesio). Subito dopo, senza risciacquare, trasferire i semi sul terreno di germinazione addizionato di 0,05 - 1 % di PPM ® v/v per le piante erbacee; addizionato di 0,2 % di PPM ® per le piante legnose. I semi con un tegumento molto duro (asparago, lupino, rose, palme ornamentali) dovranno essere lasciati in ammollo in acqua per 2 - 4 ore prima della sterilizzazione con PPM ®.


L’eliminazione della contaminazione endogena degli espianti.
Porre in agitazione dolce espianti di 1 cm o meno di lunghezza in una soluzione di ipoclorito per rimuovere la contaminazione superficiale. Risciacquare sotto acqua corrente; non è necessario eseguire questa operazione in condizioni di sterilità. Porre gli espianti in agitazione per 8 - 12 ore in una soluzione dell’1 - 2 % di PPM ® addizionata di 50 m/l di sali di magnesio, come descritto in precedenza. Senza risciacquare, trapiantare gli espianti nel terreno colturale addizionato di 0,05 - 0,1 % di PPM ® v/v per le piante erbacee e dello 0,2 % di PPM ® per le piante arboree. Esporre le piastre ad una luce di bassa intensità per i primi 5 giorni.


La sterilizzazione di tuberi, bulbi
Porre in agitazione l’intero tubero/bulbo in una soluzione di ipoclorito. Sciacquare con acqua corrente e tagliare il tubero (il bulbo) a fette sottili . Porre in agitazione per 8 - 12 ore le fette di tessuto vegetale in una soluzione al 2 - 5 % v/v di PPM ®, soluzione addizionata di 50 mg/l di sali di magnesio. Senza risciacquare trapiantare le fette in un terreno addizionato di 0,1 - 0,2 % di PPM®. Esporre le piastre ad una luce a bassa intensità per i primi 5 giorni.

Nel caso in cui le procedure descritte non producano un risultato soddisfacente, specialmente se si opera con espianti spessi o con espianti gravemente contaminati, allora si suggerisce questa alternativa:
porre in agitazione gli espianti in acqua, un’ora per tessuti vegetali teneri, 2 ore per tessuti più duri; porre poi gli espianti in agitazione in una soluzione al 50 % di PPM ® e acqua sterile per 10 - 30 minuti. Senza risciacquare trapiantare gli espianti nel terreno. Esporre le piastre a luce a bassa intensità per i primi 10 giorni. Si suggerisce di addizionare il terreno di 0,05 - 0,2 % v/v di PPM ®.

NON eliminare gli espianti con sintomi di forte ossidazione, bruciature; all’incirca il 50 % di questi si riprende dopo 4 - 6 settimane. La soluzione al 50 % di PPM ® può essere riutilizzata sino a 10 volte.


Colture in vitro contaminate

Con la miscela PPM ® si può effettuare un trattamento di “salvataggio”, purché le colture non siano state contaminate più a lungo di una settimana.
Il materiale vegetale deve essere ripulito meccanicamente con uno spazzolino sotto acqua corrente. Si prepara una soluzione di PPM ® al 50 % con acqua sterile e si immergono le piantine o gli espianti per 15 - 30 minuti. Si raccomanda di abbassare il pH fino a valori compresi tra 2,8 - 3,2, mescolando la miscela PPM ® con acido citrico.
Senza risciacquare, si trapiantano gli espianti o le piantine nel terreno addizionato di 0,05 - 0,2 % v/v di PPM ®; qui sono lasciate per un mese ed esposte ad una luce a bassa intensità per i primi 10 giorni. Aspettare ad eliminare le piante che appaiono ossidate o con bruciature.


Nota di valore generale
Dopo il trattamento di sterilizzazione con PPM ® il primo trapianto degli espianti è bene effettuarlo spingendo in profondità gli stessi nell’agar, così che il contatto del tessuto sia completo. Perciò è meglio avere disponibile in questa fase un terreno semi solido.

I terreni colturali contenenti PPM possono essere dispensati all’esterno della cappa a flusso laminare . I contenitori vanno richiusi appena il terreno agarizzato si sarà solidificato.

I terreni termolabili o termosensibili ma che contengono PPM non devono essere sterilizzati con l’impiego di filtri (0.2 micron) o autoclavati , in considerazione del fatto che saranno versati in recipienti sterili e che le soluzioni stock non siano contaminate. Si raccomanda invece di filtrare i terreni con PPM qualora contengano 200 mg/l o più di aminoacidi e proteine.

Il PPM é sotto forma di soluzione acquosa acida (pH 3,8). Esso va conservato a 4 °C. La dose raccomandata per prevenire le contaminazioni accidentali é di 0,5 - 2 ml/ l di terreno colturale. Dosi più elevate sono richieste per debellare le contaminazioni endogene.


Il Plant Preservative Mixture ® è pronto all’uso, non è fitotossico alle dosi suggerite, si conserva in frigorifero a 4 - 8 °C.

Il Plant Preservative Mixture ® è un prodotto approvato dall’EPA: Reg.n.71806-1

Plant Presevative Mixture ® migliora il livello di sicurezza per gli operatori di laboratorio!